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（一）平底和圓底（U型和V型）培養(yǎng)板的區(qū)別和選擇：
貼壁細(xì)胞一般用平底培養(yǎng)板。懸浮型細(xì)胞的培養(yǎng)一般用V型。
U型培養(yǎng)板亦多用于培養(yǎng)懸浮型細(xì)胞 。V型培養(yǎng)板有時(shí)用做免疫學(xué)血凝集的實(shí)驗(yàn)。
不同型狀的板子自然有不同用途。平底的什麼類(lèi)型的細(xì)胞都可用﹐但當(dāng)細(xì)胞數(shù)目較少﹐如做克隆時(shí)﹐就用96孔平底板﹐另外﹐做MTT等實(shí)驗(yàn)時(shí)﹐無(wú)論貼壁和懸浮細(xì)胞﹐一般均用平底板。至於U或V型板﹐一般在某些特殊要求時(shí)才使用。如在免疫學(xué)方面﹐當(dāng)做兩種不同淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)﹐需要二者相互接觸以刺激﹐因此﹐一般需要U型板﹐因細(xì)胞會(huì)由於重力的作用而聚集在一個(gè)很小的範(fàn)圍內(nèi)。V型板的用途更少﹐一般用于細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)時(shí)﹐為了使效靶細(xì)胞緊密接觸﹐常使用V型板﹐但這種試驗(yàn)也可用U型板替代(加入細(xì)胞後﹐低速離心)如果是養(yǎng)細(xì)胞的話(huà)， 通常是選用平底的， 另外要特別注意材質(zhì)， 標(biāo)示"Tissue Culture (TC) Treated"就是養(yǎng)細(xì)胞用的。
圓底的好像沒(méi)聽(tīng)說(shuō)過(guò)拿來(lái)養(yǎng)細(xì)胞。 圓底的通常是拿來(lái)做分析， 化學(xué)反應(yīng)， 或是保存樣品用的， 因?yàn)閳A底比較好將液體吸得乾淨(jìng)， 如果用平底的就不好吸了。 不過(guò)， 如果你是要測(cè)吸光值的話(huà)， 一定要買(mǎi)平底的才行。
大部分細(xì)胞培養(yǎng)都用平底培養(yǎng)板，便于鏡下觀(guān)測(cè)、有明確的底面積、細(xì)胞培養(yǎng)液面高度相對(duì)一致，還便于MTT檢測(cè)。
圓底培養(yÇŽng)板主要用于同位素?fù)饺氲膶?shí)é©—(yàn)，需要用細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞的培養(yÇŽng)，如“混合淋巴細(xì)胞培養(yÇŽng)”等。
（二）問(wèn)題集錦
問(wèn)：我看到培養(yǎng)板有4、6、12、24、48、96孔幾種規(guī)格 ，但不知道到底什么實(shí)驗(yàn)用哪種規(guī)格，請(qǐng)指教。
答：要根據(jù)你具體的實(shí)驗(yàn)要求，流式一般用6孔，MTT一般用96孔，細(xì)胞爬片一般用24孔等！要具體根據(jù)你實(shí)驗(yàn)來(lái)定！
問(wèn)：請(qǐng)問(wèn)哪位高手知道Terasaki板是什么培養(yǎng)板，與普通細(xì)胞培養(yǎng)板有什么區(qū)別？謝謝！！
答：Terasaki plate主要是用于晶體學(xué)研究，產(chǎn)品設(shè)計(jì)便于對(duì)晶體的觀(guān)察與結(jié)構(gòu)分析。有兩種sitting 和handing drop兩種方法，兩種方法應(yīng)用產(chǎn)品的外形結(jié)構(gòu)也不同。材料上選擇crystal class polymer ，特殊的材料有利觀(guān)察晶體結(jié)構(gòu)。
細(xì)胞培養(yǎng)板主要是PS材料。材料是treated sufface。便于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)與伸展。當(dāng)然還有浮游細(xì)胞的生長(zhǎng)材料，同時(shí)還有l(wèi)ow binding surface，有關(guān)更多實(shí)驗(yàn)材料上的應(yīng)用與對(duì)材料的選擇。
問(wèn)：我想測(cè)吸光度用酶標(biāo)儀，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板行嗎？請(qǐng)問(wèn)酶標(biāo)板 多孔細(xì)胞培養(yǎng)板有什么區(qū)別？
答：用多空細(xì)胞培養(yǎng)板測(cè)吸光度肯定可以拉，我們經(jīng)常用它來(lái)做樣品的蛋白定量和MTT檢測(cè)。
區(qū)別：酶標(biāo)板一般要比細(xì)胞培養(yǎng)板貴，細(xì)胞板主要做細(xì)胞培養(yǎng)，但也可以用來(lái)測(cè)蛋白濃度；酶標(biāo)板包括包被板和反應(yīng)板，一般不能用做細(xì)胞培養(yǎng)，它主要做免疫酶聯(lián)反應(yīng)后的蛋白檢測(cè)，它需要更高的要求還需要特定的酶標(biāo)工作液。如下是個(gè)用酶標(biāo)板檢測(cè)冠狀病毒IgM/IgG抗體例子：見(jiàn)網(wǎng)站
常用不同培養(yǎng)板的孔底面積及推薦加液量：不同孔板所加培養(yǎng)液的液面都不宜太深，一般在2-3mm范圍，結(jié)合不同孔的底面積就可算出各培養(yǎng)孔的適宜加液量。若加液量過(guò)多會(huì)影響氣體（氧氣）交換，而且在搬動(dòng)過(guò)程中易溢出造成污染。具體所加細(xì)胞密度依實(shí)驗(yàn)的目的不同靈活掌握。
培養(yÇŽng)器皿       é¢ç©ï¼ˆcm2）培養(yÇŽng)液量（ml）   ç´°(xì)胞量
96 孔培養(yÇŽng)板   0.32   0.1   10e5
24孔培養(yÇŽng)板   2   1.0   5×10e5
12孔培養(yÇŽng)板   4.5   2.0   10e6
6孔培養(yÇŽng)板   9.6   2.5   2.5×10e6
3.5 cm 培養(yÇŽng)çš¿   8   3.0   2×10e6
6 cm 培養(yÇŽng)çš¿   21   5.0   5.2×10e6
10 cm 培養(yÇŽng)çš¿   55   10.0   13.7×10e6
25cm2 培養(yÇŽng)瓶   25   5.0   5×10e6
75cm2 培養(yÇŽng)瓶   75   15～30   2×10e7
(一)細(xì)胞培養(yǎng)板的密閉和污染問(wèn)題：
細(xì)胞培養(yǎng)板的加樣和操作：細(xì)胞培養(yǎng)板在進(jìn)行細(xì)胞操作時(shí)同樣遵循嚴(yán)格無(wú)菌的原則，各項(xiàng)操作要保證規(guī)范、科學(xué)，不對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)造成額外的影響。這其中最常見(jiàn)的問(wèn)題就是如何保證加樣后細(xì)胞的均勻和盡量減少換液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。
問(wèn)：96，24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的蓋子都很松，這樣是方便了透氣，但是細(xì)菌、霉菌等污染物會(huì)不會(huì)也隨著溜進(jìn)去呢？
答：1.蓋子很松，屬于半開(kāi)放培養(yǎng)，這樣的目的是透氣（實(shí)際上是為了使培養(yǎng)皿外的co2能夠與培養(yǎng)皿充分交換，維持培養(yǎng)基的pH值）。
2.凡事有利必有弊，這樣當(dāng)然增加了污染的可能性。此外這樣還會(huì)使培養(yǎng)皿內(nèi)的液體蒸發(fā)，這對(duì)于精確定量的藥物來(lái)說(shuō)就顯得值得注意了。所以以下二條措施是必須的a培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須清潔（定期紫外線(xiàn)照，酒精擦洗，盡量少開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱）b培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度必須始終保持為100%（培養(yǎng)箱內(nèi)放置無(wú)菌蒸餾水的水槽）。
就好像培養(yÇŽng)皿，也是一個(gè)蓋倒扣的容器，也不會(huì)污染。主要是因?yàn)樯w子“L”型邊緣產(chÇŽn)生氣流負(fù)壓的緣故，灰塵上面才附著有微生物，而氣流攜帶的灰塵是無(wú)法通過(guò)產(chÇŽn)生負(fù)壓的蓋邊緣的。而透氣作用只是通過(guò)空氣的擴(kuò)散，不會(huì)產(chÇŽn)生氣流，所以只會(huì)透氣不會(huì)透菌。
我使用24孔板，在其中的某些孔中有操作(在超凈臺(tái)內(nèi))，而其他孔中還有細(xì)胞要培養(yǎng).我很擔(dān)心這樣會(huì)污染，不知道要注意什么?大家不知道有什么好的建議。
在超凈臺(tái)內(nèi)如果操作規(guī)范的話(huà)應(yīng)該可以的，我想你可以充分利用培養(yǎng)版的蓋子，盡量只暴露要操作的孔，將其他孔用蓋子蓋起來(lái)。這是我的一點(diǎn)粗淺的見(jiàn)解，拋磚引玉吧！
使用前綜合考慮一下，充分使用所以的孔；如果只需要使用少數(shù)的孔可以只用一邊的，其余用蓋子蓋住，我習(xí)慣于先用右側(cè)的孔（右手加樣方便）。
其實(shí)自己感覺(jué)只要注意無(wú)菌操作，一般是不會(huì)污染的。操作時(shí)用幾塊玻片把板子一側(cè)墊高，不要把蓋子全打開(kāi)，一般沒(méi)問(wèn)題。
(二)細(xì)胞分布不均及解決辦法：
問(wèn)：我的細(xì)胞接種培養(yǎng)板，細(xì)胞總是聚集在周邊部分，該如何處理啊？我看園子里有的戰(zhàn)友的細(xì)胞卻是聚集在中間，是不是板子的質(zhì)量問(wèn)題啊？
答：請(qǐng)問(wèn)你的細(xì)胞是如何混勻的？是滴管吹打還是振蕩培養(yǎng)板？如果是后者，而且是轉(zhuǎn)圈搖勻的話(huà)，很有可能由于離心力的作用使細(xì)胞甩到周邊部分，導(dǎo)致細(xì)胞中間少，四周多！自己可是試試！
周邊一般是相對(duì)會(huì)多一點(diǎn)，但是中間的數(shù)量也不會(huì)很少啊~~ 鋪板的時(shí)候我也沒(méi)有特異去振蕩培養(yǎng)板。
大概是板子的質(zhì)量問(wèn)題吧或者是不是鋪板時(shí)候的細(xì)胞密度太低了？我用的corning的板 。
一個(gè)好辦法：在你培養(yǎng)種板之前，把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)的飽和后再取出，種入細(xì)胞時(shí)力量要輕，可采取用滴頭在培養(yǎng)板孔的側(cè)面慢慢加入讓細(xì)胞懸液流入板孔中，培養(yǎng)的細(xì)胞基本是均勻生長(zhǎng)。記住千萬(wàn)不要用振蕩器振蕩，否則你的細(xì)胞就會(huì)想你說(shuō)得那樣聚積在一起。
我今天把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里幾個(gè)小時(shí)，適當(dāng)?shù)陌鸭?xì)胞密度加大了一下，另外多加了一點(diǎn)培養(yǎng)液，今晚看細(xì)胞鋪的挺好的。
我認(rèn)為有兩種可能解決你問(wèn)題的辦法:
1.加入前吹打均勻;
2.從多孔板側(cè)邊或底邊緩慢加入。
我在做原代培養(yǎng)時(shí)也遇到過(guò)這種情況，我一直以為培養(yǎng)皿鋪膠不均勻會(huì)導(dǎo)致這種現(xiàn)象，因?yàn)榛靹虻难芏渭尤氲脚囵B(yǎng)皿中時(shí)，在相差顯微鏡下血管段均勻分布在培養(yǎng)皿中，24h后貼壁的血管段就是周邊多，中間相對(duì)少些。下次我要試試hkqu戰(zhàn)友的方法看能否改變這種現(xiàn)象。謝謝指點(diǎn)！
這種現(xiàn)象很正常呀，不知你仔細(xì)觀(guān)察過(guò)æ²’(méi)有，孔直徑愈小，這個(gè)現(xiàn)象越明顯，我試過(guò)，24、96孔板這種現(xiàn)象不可避免，因?yàn)橐后w的附壁使得孔內(nèi)培養(yÇŽng)液不是成一個(gè)液平面，而是周邊高，就像凹鏡一樣，而使用這兩種孔板由于需要加干預(yù)等原因而不能加足量培養(yÇŽng)液，使得細(xì)胞隨培養(yÇŽng)液一起出現(xiàn)“邊集”現(xiàn)象，如果為了使孔中央也有均勻細(xì)胞而增加接種細(xì)胞數(shù)量的話(huà)，這要看你需要觀(guān)察何種指標(biāo)，如果是MTT ，免疫組化的話(huà)會(huì)å› ?yàn)榧?xì)胞成層而影響結(jié)果。
贊成hkqu戰(zhàn)友的建議，個(gè)人認(rèn)為消化細(xì)胞時(shí)要注意吹打均勻，避免細(xì)胞成團(tuán)，而且孔內(nèi)培養(yÇŽng)液量要足夠，我一般接種時(shí)加足量培養(yÇŽng)液，加干預(yù)時(shí)換一次液，干預(yù)液加培養(yÇŽng)液量等于接種時(shí)培養(yÇŽng)液量，這樣的話(huà)“邊集”現(xiàn)象會(huì)有所改觀(guān)，不妨一試。
我想我們做課題，實(shí)é©—(yàn)的目的是為了驗(yàn)證或探索某些理論，而不是要所謂的“好看”，“美”。還記得魯迅先生的文章《藤野先生》一文嗎？我們很多年以前學(xué)過(guò)的，藤野先生對(duì)魯迅先生說(shuō)得話(huà)大家不防重溫一下，我想這正是我們要學(xué)ç¿’(xí)的地方。
我做的是空斑形成實(shí)驗(yàn)，最好是細(xì)胞鋪成均勻的一層，昨天接種病毒時(shí)大部分孔都還好，個(gè)別的不太均勻。
現(xiàn)在我細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也做了一段時(shí)間了，但在實(shí)驗(yàn)中平行組的差距還是比較大。
有時(shí)候一組數(shù)據(jù)大多是差不多的，偏偏會(huì)跳出一個(gè)相去甚遠(yuǎn)的數(shù)據(jù)。
我想應(yīng)該不是我細(xì)胞加入時(shí)的問(wèn)題，因?yàn)槲业慕M間差距大是出現(xiàn)在加樣的組中，而對(duì)照組的數(shù)據(jù)卻相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定。另外，我的樣品是完全均勻的液體，照理應(yīng)該是不會(huì)出現(xiàn)上述問(wèn)題的。
我也出現(xiàn)了這樣的問(wèn)題。我加入細(xì)胞的時(shí)候是用吸管邊吹打邊用一毫升的槍加入12孔板中的，可是組內(nèi)差異仍然很大，想請(qǐng)教一下大家加細(xì)胞的時(shí)候都有什么方法呀？
我覺(jué)得有幾點(diǎn)：
1.細(xì)胞消化后吹打成單細(xì)胞懸液很關(guān)鍵！保證分板時(shí)每個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)目是一致的！
2.當(dāng)然還有你的處理因素各個(gè)孔之間的平行也很重要，比如說(shuō)加藥時(shí)，藥物稀釋后混勻，保證每個(gè)孔的濃度是一致的！
3.再者加細(xì)胞和藥物時(shí)，要試驗(yàn)組和對(duì)照組一塊輪流加，避免加樣先后順序?qū)е录?xì)胞密度和藥物濃度的差異！！
吹打已經(jīng)是均勻了，但是鋪板，6孔，24孔總有些不均勻的哦，有點(diǎn)愛(ài)往中間集中。而且明明計(jì)數(shù)好了鋪了，長(zhǎng)一兩天，各個(gè)孔密度就有點(diǎn)不一樣，對(duì)檢測(cè)有影響，能指教一下，有良策嗎？
1.如果用巴氏吸管鋪的話(huà)，每次吸取的量不要太多，因?yàn)槲軆?nèi)的細(xì)胞會(huì)自動(dòng)向下沉，往往第一開(kāi)始幾個(gè)孔細(xì)胞數(shù)多，經(jīng)常均勻細(xì)胞懸液，加液走S型路線(xiàn)。
2.如果用移液器的話(huà)，tips要處理下，把尖端去掉避免損傷細(xì)胞，這樣每一次取液對(duì)應(yīng)一個(gè)孔。用tip一對(duì)一孔加入比較準(zhǔn)確。但也要注意混勻懸液。
3.設(shè)立平行組，n要足夠大（可以計(jì)算一下）。
4.鋪板后不要搖，因?yàn)閾u動(dòng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞向中間聚集。最好鋪板一次搞定。
鋪板后不要做圓周的晃動(dòng)，做十字晃動(dòng)，即上下左右晃動(dòng)，否則會(huì)使細(xì)胞旋到當(dāng)中去。
移液器的槍頭沿著培養(yǎng)板壁加，就不會(huì)集中到中間了。
(三)6孔板接種和換液：
問(wèn)：我的細(xì)胞傳代很正常，但一種到六孔板里（不管加藥和對(duì)照），總有兩三個(gè)孔（隨機(jī)）細(xì)胞長(zhǎng)得不好，很小，像破碎了。有人遇到過(guò)這種情況嗎？到底是啥原因呢？請(qǐng)各位指點(diǎn)
答：可能跟你加液的溫度有關(guān)。如果你細(xì)胞剛剛拿出來(lái)?yè)Q液加液，培養(yǎng)基也是從4度冰箱拿出來(lái)不久，很容易細(xì)胞就會(huì)凍死了。建議你最好把培養(yǎng)基先在培養(yǎng)箱里邊孵育15min先。
另外，跟你細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)也有關(guān)。加藥之前的細(xì)胞可以用高點(diǎn)的血清濃度培養(yǎng)。保證細(xì)胞狀態(tài)良好。
或者放在37度水浴鍋里孵育也可以，或者是培養(yǎng)板本身的問(wèn)題，你再換換其他培養(yǎng)板試試看。再有可能就是細(xì)胞狀態(tài)問(wèn)題了，種板時(shí)的血清濃度調(diào)高試一下
問(wèn)：最近幾天，我用六孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后更換培養(yǎng)基，在更換培養(yǎng)基之前，顯微鏡觀(guān)察到細(xì)胞貼壁，狀態(tài)非常的好，更換了培養(yǎng)基后，立即用顯微鏡觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)每個(gè)孔中都近乎有一半的細(xì)胞表現(xiàn)出近乎死亡的狀態(tài)。細(xì)胞變得非常小，產(chǎn)生大量的碎片，而另一半的細(xì)胞一切正常，異常細(xì)胞與正常細(xì)胞之間存在一條分水嶺，上半個(gè)圓是好的，下半個(gè)圓就不好，這是怎么一回事？
答：你可以看一下是不是培養(yǎng)板沒(méi)放水平。有一回我也出現(xiàn)過(guò)這種情況。
你的培養(yǎng)液如何，如果培養(yǎng)液過(guò)期，細(xì)胞就不會(huì)貼壁。換一點(diǎn)新配制的培養(yǎng)液試一試。
我也經(jīng)常碰到，我想可能是板的問(wèn)題，換一個(gè)牌子的板或換用培養(yǎng)瓶就沒(méi)問(wèn)題了。
不知樓主所需換液的培養(yǎng)板多不多，換培養(yǎng)基的時(shí)候如果沒(méi)有注意風(fēng)機(jī)的影響，特別是所需換液的培養(yǎng)板很多時(shí)，容易使細(xì)胞因風(fēng)吹失水而干縮破裂。如果如此，換液時(shí)應(yīng)該逐個(gè)培養(yǎng)板進(jìn)行，別怕浪費(fèi)吸管，注意操作的效率！
(四)24孔板接種：
問(wèn)：我把細(xì)胞消化接種到24孔板之后，已經(jīng)四天了，老是每孔的中間部分長(zhǎng)不滿(mǎn)，每天換液時(shí)都用PBS 清洗，第二天換液時(shí)都出現(xiàn)同樣的情況，每孔的邊緣長(zhǎng)的很好，中央大量死細(xì)胞，我也不知道是什么原因，請(qǐng)各位高手仁兄給把把脈，先謝過(guò)！！！！！！！！
答：是中央長(zhǎng)不滿(mǎn)，還是中央有和邊緣相同密度的細(xì)胞，但是大部分都是死細(xì)胞？如果是前者，也許不是技術(shù)問(wèn)題，而是物理問(wèn)題了。
我是選擇孔內(nèi)鋪蓋玻片，在玻片上種植。每次換液都用PBS洗，必要的步驟嗎？另外，也有可能和細(xì)胞種類(lèi)有關(guān)或者和培養(yǎng)液有關(guān)？
我想你的培養(yǎng)液可能加的太少了。由于表面張力的作用，培養(yǎng)板的邊緣液體會(huì)向上走，造成培養(yǎng)液面呈現(xiàn)一個(gè)凹面（就像量筒的液體凹面一樣），中央的細(xì)胞正好在凹面的最低處，培養(yǎng)液少，細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)不夠，甚至干涸掉，空氣中的氧氣也會(huì)造成損傷，即使有增值過(guò)來(lái)的細(xì)胞也會(huì)死掉。
估計(jì)你的培養(yÇŽng)液里可能有貴重的“銀子”（因子）啊，想少用點(diÇŽn)吧，結(jié)果就…… ：）
另外，檢查一下培養(yǎng)箱底部的水是否少了，如果少了，箱內(nèi)的空氣濕度不夠，會(huì)造成培養(yǎng)液揮發(fā)加快，這樣即使剛加的液體不少，過(guò)一段時(shí)間，由于蒸發(fā)，液體量會(huì)減少，造成中央干涸。并且這樣會(huì)改變了培養(yǎng)液的成分濃度，造成滲透壓過(guò)高。
個(gè)人經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為這是物理問(wèn)題:24孔板小，細(xì)胞接種進(jìn)去后是很難搖均勻的，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞重貼壁后呈現(xiàn)四周密中間稀的狀況.
至于中間較多死細(xì)胞，如果是懸浮狀的話(huà)，也一樣是物理問(wèn)題。接種后比較粗暴的碰撞，似乎對(duì)搖均勻細(xì)胞有一定效果.
在為多孔板培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)一定要注意，不要把培養(yǎng)基吸得太干，如果完全吸取，很容易造成細(xì)胞干涸，這樣的話(huà)細(xì)胞會(huì)很快死亡。我有一段時(shí)間總是遇到這個(gè)問(wèn)題，一個(gè)板子中總有一兩個(gè)孔出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡，后來(lái)發(fā)現(xiàn)是上面的原因。現(xiàn)在我做的時(shí)候如果必須把液體吸干，我會(huì)一個(gè)一個(gè)空來(lái)吸取，最多一次不超過(guò)3孔，然后馬上加入液體，同時(shí)在作轉(zhuǎn)染時(shí)，我會(huì)在吸液和加液時(shí)將風(fēng)機(jī)關(guān)掉，這樣基本上會(huì)避免細(xì)胞死亡。
同時(shí)你所說(shuō)的細(xì)胞周?chē)芏虚g稀疏，大約有如下原因：
1.培養(yǎng)液加得太少。主要是由于液體張力的問(wèn)題。
2.細(xì)胞接種后震蕩太厲害了。由于離心力作用導(dǎo)致細(xì)胞分布到周?chē)?/span>
我的細(xì)胞在接種在24孔板上時(shí)，孔的 周?chē)?xì)胞密集，中間細(xì)胞稀少，我試了很多次均如此。請(qǐng)問(wèn)怎樣操作才能使細(xì)胞分布均勻？
周?chē)?xì)胞密集，中間細(xì)胞稀少
這種情況一般是種板時(shí)培養(yǎng)液過(guò)少，液面總是呈一凹面，如果液面過(guò)低，孔中間就基本上沒(méi)什么細(xì)胞，所以種板時(shí)一定不能吝嗇培養(yǎng)液，待貼壁后可以用比較少量的培養(yǎng)液處理
周?chē)?xì)胞稀少，中間細(xì)胞密集:這種情況一般是種板后過(guò)于晃動(dòng)，特別是旋轉(zhuǎn)著晃動(dòng).有人才用十字方向的晃動(dòng)方法使細(xì)胞分散均勻.但我個(gè)人認(rèn)為，將細(xì)胞加入孔后，用槍或移液器充分吹打混勻后就不用，也不能再晃動(dòng)，甚至拿著孔板走路帶來(lái)的震動(dòng)都會(huì)讓細(xì)胞往中間集中.
當(dāng)然，無(wú)論是哪種情況，首先都需要保證細(xì)胞在種板時(shí)時(shí)均勻分布的，即種板時(shí)的細(xì)胞懸液一定要混勻
細(xì)胞分布均勻與否有一點(diǎn)很關(guān)鍵，即每種細(xì)胞是有個(gè)體差異的，別人的細(xì)胞操作不一定適合于你.所以要靠自己摸索，且找出專(zhuān)屬于自己細(xì)胞的一套規(guī)律，就我個(gè)人而言，有如下經(jīng)驗(yàn)：
1.所有待接種的細(xì)胞懸液在種板前一定要用吸管混勻。
2.按資料記載，24孔板的液體量為1ml，個(gè)人也覺(jué)得1ml的量足矣。
3.接種時(shí)，要慢慢加樣，且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭，這樣做對(duì)細(xì)胞均勻分布有一定效果。
4.接種后最好直接放入培養(yǎng)箱讓細(xì)胞適應(yīng)培養(yǎng)板這個(gè)新的環(huán)境，個(gè)人認(rèn)為沒(méi)有必要在室溫放置一段時(shí)間。
5.根據(jù)細(xì)胞的特性，細(xì)胞均喜歡聚集在邊緣生長(zhǎng)，所以我考慮到，你的問(wèn)題還有可能是接種時(shí)的細(xì)胞密度不夠，導(dǎo)致周邊密集，中間稀疏的錯(cuò)覺(jué)。你的拌種密度是多少？
另"要慢慢加樣，且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭"的意思就是:加樣不能太快，避免細(xì)胞在一個(gè)加樣處聚集，且注意在不同的部位進(jìn)行加樣，即邊加邊活動(dòng)槍頭，人為使細(xì)胞趨于均勻分布，我個(gè)人覺(jué)得有一定的效果，不知這次我解釋清楚沒(méi)有。
五)96孔板細(xì)胞接種換液和收集細(xì)胞
問(wèn)：最近我用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，結(jié)果細(xì)胞長(zhǎng)得不是很理想，不是長(zhǎng)得不均勻，就是每個(gè)孔細(xì)胞生長(zhǎng)速度不一樣。另外，鏡下觀(guān)察細(xì)胞輪廓很不清晰，怎么調(diào)焦距效果都不好。（板子是剛拆封的。）不知道怎么回事？
答：You should make sure that you triturate the cells very well. If the cells tend to form clumps， use a pasteur pipet and pass the cells several times. Then count the cell using Trypan Blue. Plate 1-5*10^4 per well， depending on your desired density. Usually， only the 60 wells in the middle should be used for plating cells. Wells on the edge will have a decreased volume of media， so you should not add any cells in there， but you still need to put media or H2O inside those 36 wells.
首先你要盡可能把消化細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞（不要成團(tuán)），反復(fù)吹打，掌握好時(shí)間（不同的細(xì)胞要摸索的），種細(xì)胞時(shí)要均勻的吸取，清清的吹打一遍再吸取細(xì)胞，這樣也許會(huì)解決您的問(wèn)題。我以前也是出現(xiàn)這樣問(wèn)題。后來(lái)就很好了！！
種到96孔板的細(xì)胞一定要消化成單個(gè)細(xì)胞，建議用EDTA和胰酶消化。加血清后反復(fù)吹打。細(xì)胞量盡量少一點(diǎn)。
我一般在鋪板時(shí)都是用八排槍加樣的，感覺(jué)效果還不錯(cuò)。首先如樓上所說(shuō)要把細(xì)胞消化的恰到好處，背著光看瓶底細(xì)胞都下來(lái)后再對(duì)著瓶壁吹打幾次即可。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到加樣槽中，在加樣過(guò)程中，要不停的輕輕晃動(dòng)加樣槽，且在每次吸樣前都吹打幾次，以防細(xì)胞不是均勻的分散在培養(yǎng)基中，造成加樣不均。加樣時(shí)使槍頭貼著孔壁緩慢加入，使液體自然流滿(mǎn)即可。都加完后平穩(wěn)拿到鏡下觀(guān)察鋪的很漂亮的。聽(tīng)別人說(shuō)鋪完后在96孔板的四個(gè)角輕輕磕幾下，但我試過(guò)，這樣效果反倒不好！
我覺(jué)得你的問(wèn)題可能是消化的不好，我的經(jīng)驗(yàn)希望能有幫助：
1、對(duì)細(xì)胞的選擇要注意，要選擇狀態(tài)好的細(xì)胞，密度要選分布瓶底80％為宜；
2、消化時(shí)，不要忘了用PBS（或純的不含血清的培養(yǎng)基）洗一遍，加0.25％的胰酶1ml消化2-3分鐘（不同的細(xì)胞有差別，你要摸索），還要不時(shí)的活動(dòng)，讓胰酶分布到每個(gè)角落，之后傾去胰酶，加3ml培養(yǎng)基（我認(rèn)為加血清過(guò)于粘稠，不宜吹打，加培養(yǎng)基后稀釋胰酶可不考慮對(duì)細(xì)胞的損傷），吹打成單個(gè)細(xì)胞；
3、接種時(shí)要注意細(xì)胞密度，多數(shù)細(xì)胞要求0.5-2的10的4次冪，這也要摸索一下（簡(jiǎn)單：就是你種一個(gè)密度，如果在你測(cè)指標(biāo)時(shí)細(xì)胞沒(méi)過(guò)多影響結(jié)果就行）；
4、周邊的孔不要做指標(biāo)檢測(cè)孔，你有沒(méi)有發(fā)現(xiàn)周邊的孔的細(xì)胞2天后狀態(tài)就明顯不好了；
5、接種細(xì)胞調(diào)整好濃度后，要一邊吹細(xì)胞懸液一邊接種；
6、還有你說(shuō)看不清細(xì)胞，你注意到?jīng)]有，當(dāng)把培養(yǎng)板那出孵箱一會(huì)，培養(yǎng)板蓋就有一層霧，會(huì)影響觀(guān)察細(xì)胞，你是不是這個(gè)問(wèn)題？？
問(wèn)：我在96孔培養(yǎng)板上接種的細(xì)胞很均勻，但換液時(shí)，我用槍加150ul的培養(yǎng)基加入每個(gè)孔內(nèi)，結(jié)果在顯微鏡下觀(guān)察周邊細(xì)胞全被沖到孔中央去了，而中間的細(xì)胞層疊成致密的團(tuán)塊.請(qǐng)問(wèn)這樣的細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)有影響嗎?有其他的好辦法嗎? 是3T3-L1前脂肪細(xì)胞，要進(jìn)行誘導(dǎo)分化成成熟脂肪細(xì)胞。所以我每次換液總把握不好。請(qǐng)問(wèn)有誰(shuí)有這方面的經(jīng)驗(yàn)嗎?
答：我們實(shí)驗(yàn)室一般用機(jī)械吸引器吸引，吸引器管前面套一個(gè)20ul加樣器的Tip頭，效果不錯(cuò)，操作在無(wú)菌臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。Tip頭剪去尖端后滅菌使用，加液時(shí)液體呈滴狀滴入，就不會(huì)擾動(dòng)孔底的細(xì)胞了。
3T3-L1前脂肪細(xì)胞不是貼壁的嗎？怎么會(huì)這么容易被沖到中間去？
我只聽(tīng)說(shuō)過(guò)第一次把細(xì)胞加到孔中的時(shí)候很容易讓細(xì)胞長(zhǎng)得不均勻，3T3-L1前脂肪細(xì)胞要是貼壁了不容易被沖走了吧，要不然就不要用胰酶消化了，呵呵！！
建議：加液的時(shí)候沿著邊輕輕的加入，動(dòng)作柔和，可以避免沖動(dòng)細(xì)胞；去液的時(shí)候直接甩板，方便快捷。
去液的時(shí)候不建議直接甩板，容易污染。可以剪掉tip尖，不能直接沖細(xì)胞，沿孔壁輕輕加入，液體提前在孵箱里預(yù)熱10分鐘，有時(shí)候液體涼也會(huì)使細(xì)胞掉下來(lái)。
是換完液馬上就卷了，還是過(guò)一會(huì)兒才卷的？我覺(jué)得這個(gè)細(xì)胞狀態(tài)不好的時(shí)候是容易卷的，我誘導(dǎo)后換維持培養(yǎng)液時(shí)細(xì)胞卷的很厲害，原來(lái)也以為是換液造成的，后來(lái)觀(guān)察了一下不是。你在仔細(xì)分析一下，一定是換液造成的馬？一般帖壁細(xì)胞換液時(shí)即使是沖也只是一小部分破掉，不會(huì)大面積掉下來(lái)的，我認(rèn)為。
換完液馬上就卷了，細(xì)胞好象是一大片全掉下來(lái)拉，并在浮動(dòng)，然后我第二天在看時(shí)就發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全堆在中間，我也沒(méi)在意，繼續(xù)換液.但現(xiàn)在是我把細(xì)胞從培養(yǎng)箱里拿出來(lái)肉眼就能看到每個(gè)孔中間有一個(gè)小白點(diǎn).我以為是污染了，拿到顯微鏡下看又不太像，自己感覺(jué)是細(xì)胞疊在一起長(zhǎng)的太密了.因?yàn)槟芸吹胶苤旅艿募?xì)胞團(tuán).而周?chē)募?xì)胞輪廓很清晰，但不是很多.為這個(gè)實(shí)驗(yàn)我已經(jīng)鋪了5塊96孔板了，真不想再這樣繼續(xù)盲目下去.
我在96孔板中誘導(dǎo)細(xì)胞換液一般采用半量換液，這樣細(xì)胞就不會(huì)被沖走了，至于換液的間隔與細(xì)胞有關(guān)，我誘導(dǎo)肝細(xì)胞是隔天半量換液。如果卷得特別厲害，很可能是細(xì)胞的問(wèn)題，建議更新細(xì)胞株。
問(wèn)：我的細(xì)胞對(duì)胰酶和ＥＤＴＡ不管用．高濃度胰酶可以，但細(xì)胞存活率不高．有沒(méi)有小的細(xì)胞刮匙，（或者自制刮匙的方法），可以用于９６孔板？（我在建細(xì)胞系，非得用９６孔板）．謝謝！
一般情況下細(xì)胞在一次性培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中貼壁較緊，都不太好消化，如果建系的話(huà)最好不用刮的方法，還是消化比較好！消化時(shí)以下幾點(diǎn)注意了嗎？
消化前用D-Hanks沖洗了嗎？可以沖洗2-3遍。
適當(dāng)增加胰酶濃度，提高胰酶PH值到8，減少消化時(shí)間應(yīng)該對(duì)細(xì)胞影響不大。消化時(shí)放入37度培養(yǎng)箱。
如果細(xì)胞還是消化不下來(lái)可加適量膠原酶，有的細(xì)胞對(duì)膠原酶敏感。
市場(chǎng)上有買(mǎi)細(xì)胞刮刀，但是我用過(guò)的型號(hào)不適用與96孔。我在做96孔單克隆時(shí)一般采用酶消化法。 同意上樓的說(shuō)法，消化前將細(xì)胞用D-Hanks沖洗，有助與消化，另外胰酶的最佳消化條件是 pH 8.0，37度最好. 如果效果還是不太好的話(huà)，可以采用多次消化方法。
問(wèn)：D-Hanks和PBS沖洗效果有何不同？我在胰酶消化前一直用PBS沖洗。
首先，D-Hanks和PBS沖洗細(xì)胞都可以的，我兩種都用過(guò)，不過(guò)嚴(yán)格來(lái)說(shuō)我認(rèn)為D-Hanks更好，因?yàn)槲覀兊囊让甘怯肈-Hanks溶的，所以用D-Hanks不改變胰酶的消化環(huán)境。
第二個(gè)問(wèn)題，完全可以不用wash，加入帶血清的培養(yÇŽng)基之后胰酶將完全沒(méi)有作用，我一般都是這樣做的，但是如果EDTA濃度太高的話(huà)就需要wash了！  
培養(yǎng)板的包被及相關(guān)問(wèn)題：為了適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)需要，可對(duì)培養(yǎng)板用不同的物質(zhì)進(jìn)行包被后使用，這其中有促進(jìn)細(xì)胞黏附的，也有用于一些特殊檢測(cè)需要的。不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡芫唧w的方案亦不同，根據(jù)需要靈活掌握。
(一)多聚賴(lài)氨酸包被：
問(wèn)：我要培養(yǎng)原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，要用多聚賴(lài)氨酸鋪細(xì)胞培養(yǎng)板，請(qǐng)問(wèn)賴(lài)氨酸液怎么配，怎樣鋪扳子
答：配制0.01%的多聚賴(lài)氨酸: 首先買(mǎi)來(lái)sigma 公司的多聚賴(lài)氨酸，如是25mg，就需要250ml三蒸水，用移液管將 少量三蒸水加到多聚賴(lài)氨酸的小塑料瓶中，然后將溶解的多聚賴(lài)氨酸加到200ml左右三蒸水中，(已置燒杯中)。最后加三蒸水達(dá)250ml，過(guò)濾除菌分裝與小瓶中即可。保存于-20度，近期用的話(huà)可放于4度冰箱內(nèi)保存。 注意每一小瓶的量不要太滿(mǎn)，若20ml的瓶子，只裝15ml可，若太滿(mǎn)，放于-2度有可能會(huì)將瓶子弄碎，因凍后體積增加。(我就有這個(gè)教訓(xùn)) 另外燒杯，小瓶、移液管都要滅菌處理的，泡酸高壓什么的。我們用的是一種用注射器過(guò)濾的過(guò)濾器，一次性的。一個(gè)能最多有效 過(guò)濾200ml。
鋪板的操作:首先要在消毒實(shí)驗(yàn)室，包括超凈臺(tái)，紫外消度20-30分鐘。消毒后30分鐘進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。事先準(zhǔn)備100ml三蒸水，經(jīng)高壓滅菌處理。具體細(xì)節(jié)就不多說(shuō)了。
首先打開(kāi)板子，用消毒好的試管將0.01%的多聚賴(lài)氨酸加入每一孔中，大概每孔3-4滴吧。將板子蓋好放到培養(yǎng)箱中(37度 5%CO2)30分鐘。
取出板子，用吸管將多聚賴(lài)氨酸吸出。換吸管，加入三蒸水，沖洗三次，即將每孔內(nèi)加入三蒸水，沒(méi)過(guò)底，多點(diǎn)也行。再將水吸出來(lái)。反復(fù)三次。注意換吸管，要無(wú)菌操作的。
最后將鋪好的板子放于培養(yǎng)箱待用。
如果你做免疫組化，需要放小的玻片到孔內(nèi)，就在加多聚賴(lài)氨酸之前用無(wú)菌的鑷子將無(wú)菌的玻片夾到孔內(nèi)即可。
問(wèn)：PLL的分子量有3-5萬(wàn)，7-15萬(wàn)，15-30萬(wàn)幾種，應(yīng)怎樣選擇？？謝謝：）
答：我們養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，用的是分子量3萬(wàn)到7萬(wàn)的pll 。
以PBS配成1mg/ml的母液，－20度保存。使用時(shí)，用高純度的蒸餾水稀釋成0.11mg/ml的使用濃度，過(guò)濾除菌，以50微升每平方厘米的量均勻涂于培養(yǎng)底物的表面，室溫下靜置5min，吸除多余液體，股風(fēng)吹干即可。
問(wèn)：多聚賴(lài)氨酸包被培養(yǎng)板后看上去應(yīng)該是什么樣的？？
要做原代培養(yǎng)，為了促進(jìn)細(xì)胞貼壁，擬用PLL包被培養(yǎng)板。
1.我買(mǎi)的是博士德分裝Sigma的10ml的那種，可是院子里搜了一下，有人說(shuō)沒(méi)有做過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，不確定能否用于細(xì)胞培養(yǎng)！！這怎么辦，不能用么？
2.我的方法是這樣的，取了0。5ml，加入5毫升滅菌去離子水后，分成6份0.9ml，6孔板里放上玻片（準(zhǔn)備以后做免疫組化直接取片子的），一個(gè)孔一份，室溫5分鐘后吸掉液體，超凈臺(tái)內(nèi)吹干過(guò)夜。第二天D-Hank's液洗3遍，晾干，紫外線(xiàn)照一會(huì)兒再用。請(qǐng)問(wèn)這樣做有沒(méi)有硬傷？？
3.包被好后的板底及玻片應(yīng)該是什么樣的呢？？我發(fā)現(xiàn)板子干了以后，上面有些白點(diǎn)點(diǎn)，一開(kāi)始以為是水滴，后來(lái)發(fā)現(xiàn)不是。莫非是PLL，那也是不是太夸張了？？請(qǐng)問(wèn)這種現(xiàn)象正常否？？
PDL有用于組化玻片包被的不能用于細(xì)胞培養(yǎng)，你在用前需先確定是細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)的，細(xì)胞培養(yǎng)板用PDL包被完后是看不出什么的，如果有顆粒是PDL在配制是未完全溶解，可看一下說(shuō)明書(shū)。
我包被完用無(wú)菌水洗板子2－3次，吹干后很干凈，以前用PBS洗，吹干后也發(fā)現(xiàn)有白點(diǎn)，考慮是PBS中的鹽沉淀。
(二)明膠包被：
問(wèn)：在細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)瓶里鋪明膠，國(guó)產(chǎn)的明膠也以可用嗎？它是用什么配置呢？還有怎么消毒明膠呢？請(qǐng)多指教，謝謝！
答：國(guó)產(chǎn)明膠不太好用，明膠可以用PBS溶液溶解，一般在100度煮15分鐘，趁熱分裝，分裝后放在4度，不要冰凍。
問(wèn)：明膠消毒之后可以放置多長(zhǎng)時(shí)間？還是現(xiàn)配現(xiàn)用呢？你說(shuō)的分裝是指直接鋪在培養(yǎng)瓶嗎？如果不是的話(huà)，放在4度冰箱不是已經(jīng)固定了嗎？固定之后有怎么鋪在培養(yǎng)瓶呢？因?yàn)槭菦](méi)做過(guò)實(shí)驗(yàn)所以很不明白。

答：sigma 有現(xiàn)成的終濃度是2%的明膠，已消毒，買(mǎi)來(lái)即可使用，方便而且不貴，僅100多塊錢(qián)。4度時(shí)明膠是膠凍狀，室溫下放置20-30分鐘就可變成液態(tài)，說(shuō)明書(shū)上建議使用的包被密度是5-10ug/cm2。

國(guó)產(chǎn)明膠就可以的，用去離子水配成1%即可。可以一次配50ml或100ml。使用時(shí)取你所需量高壓滅菌即可。滅菌結(jié)束取出稍涼就可以鋪在培養(yǎng)瓶中。
問(wèn)：明膠包板完畢后，培養(yǎng)皿要干燥呢還是保持濕潤(rùn)？
答：明膠包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶24小時(shí)后， 將明膠倒掉，用培養(yǎng)基沖洗，就可以接種細(xì)胞了。
問(wèn)：在園里搜索了一下關(guān)于明膠在細(xì)胞培養(yǎng)中的使用問(wèn)題，還是有很多問(wèn)題大家沒(méi)有詳細(xì)和標(biāo)準(zhǔn)的說(shuō)明，現(xiàn)有幾個(gè)具體問(wèn)題，請(qǐng)教各位戰(zhàn)友，
1.明膠溶液配置的問(wèn)題:用無(wú)菌PBS配還是用去離子水配?我們實(shí)驗(yàn)室有國(guó)產(chǎn)的明膠，很大一瓶的那種，能不能用于細(xì)胞培養(yǎng)?難道一定要用GIBCO 20ML即用型的?
2.明膠使用濃度的問(wèn)題:有說(shuō)0.1%，1%和2%的，我養(yǎng)的是內(nèi)皮細(xì)胞，應(yīng)該用哪種濃度呢?
3.明膠消毒的問(wèn)題:有人說(shuō)可以高溫高壓滅菌，有人說(shuō)應(yīng)該要過(guò)濾。。。還有人說(shuō)要先高壓再乘熱過(guò)濾?不會(huì)吧，到底要怎樣?暈啊~~~
4.明膠包被培養(yǎng)瓶的問(wèn)題:有人說(shuō)包被后置培養(yǎng)箱過(guò)夜，用時(shí)在棄溶掉的，加PBS和培養(yǎng)液沖洗。。也有人說(shuō)包被后吹干30min-60min 。再加培養(yǎng)液沖洗即可用，到底怎么個(gè)做法啊
5.明膠包被后的培養(yǎng)瓶使用期的問(wèn)題:包被后的培養(yǎng)瓶能夠用多久呢?有文獻(xiàn)說(shuō)包被7天，干2-3天后放4度保存可以在兩周內(nèi)使用。
答：Q1.明膠溶液配置的問(wèn)題
A1: 用去離子水來(lái)配即可。國(guó)產(chǎn)的行不行要去試驗(yàn)，保險(xiǎn)的就是買(mǎi)進(jìn)口的。其實(shí)通常是買(mǎi)Sigma的gelatin粉末來(lái)配就好了，不用買(mǎi)配好現(xiàn)成的。配好的濃縮液可分裝放-20度長(zhǎng)期保存，即將要用的濃縮液可放4度來(lái)備用。
Q2.明膠使用濃度的問(wèn)題
A2:1%是濃縮母液的濃度，使用前才取適量稀釋成0.1%來(lái)包被。
Q3.明膠消毒的問(wèn)題:
A3: Gelatin是用高溫高壓殺菌的， 其他你所說(shuō)的方法也不是不能用， 只是沒(méi)必要。
Q4.明膠包被培養(yǎng)瓶的問(wèn)題
A4:通常是包被1小時(shí)就夠了，然後吸乾，不需要清洗。因?yàn)槟闩鋑elatin溶液中並沒(méi)有含其他有害的物質(zhì)， 沖洗只是多了一道沒(méi)必要的工作。包被完要清洗是Collagen才需要的。
Q5.明膠包被后的培養(yǎng)瓶使用期的問(wèn)題
A5.這個(gè)我不知道，但基本上是越快使用越好。由於包被的過(guò)程很快，所以我都是當(dāng)天包被， 在等的過(guò)程中可以去做其他的事，包被即將完成的前20分鐘就開(kāi)始處理細(xì)胞，等細(xì)胞收下來(lái)包被也就做好了， 馬上就用。

0.1%的明膠適合大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的包被，在四度放置不會(huì)出現(xiàn)凝膠狀。我參考的文獻(xiàn)說(shuō)內(nèi)皮細(xì)胞用1％的明膠包被，也就是母液，它在四度放置時(shí)會(huì)適度凝結(jié)。我的內(nèi)皮細(xì)胞用1％的明膠包被效果我覺(jué)得還不錯(cuò)。
不管你用包被1小時(shí)的方法還是包被4小時(shí)的方法，都最好從包被開(kāi)始到使用的間隔不超過(guò)一天，包被的容器放置時(shí)間越長(zhǎng)越不好。
(三)纖連蛋白（(Fibronectin， FN）包被：
å› ?yàn)檎n題需要，我要養(yÇŽng)人外周血來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞，得先用human fibronectin包被培養(yÇŽng)板。但是昨晚我看了個(gè)通宵，把園子里關(guān)于FN包被培養(yÇŽng)板的帖子大致瀏覽了一遍，反而越看越糊涂了——幾乎就是百家爭(zhÄ“ng)鳴的局面：
從稀釋融解開(kāi)始，有人說(shuō)不能用三蒸水，要用制藥用的純水，否則PH值不對(duì)會(huì)影響活力；有人說(shuō)用PBS，有人說(shuō)用加了尿素的PBS；母液的濃度一般說(shuō)是1mg/ml，但是買(mǎi)來(lái)的FN一般就是1mg，按這個(gè)濃度配置母液只能得到1ml，這么小的量如何分裝啊？
至于包被的濃度，差異更是很大，有人說(shuō)各個(gè)公司的產(chǎn)品不一樣，還是以說(shuō)明書(shū)上說(shuō)的為準(zhǔn)，是不是這樣啊？
另外，包被的方法，有4度過(guò)夜的，有37度過(guò)夜的，有37度2至3個(gè)小時(shí)的，還有四度過(guò)夜或37度2至3個(gè)小時(shí)çš„……
我買(mǎi)的是ROCHE的1mg裝human fibronectin，用的是corning的24孔板，最后對(duì)各種方案進(jìn)行了摸索，結(jié)果見(jiàn)下面的帖子。
剛剛又再看了一下濃度的問(wèn)題，大致歸結(jié)為以下三種方案：
1.園子里大部分戰(zhàn)友用的還是50微克/毫升的濃度，室溫或37度下放置30至40分鐘。
2.我請(qǐng)教了有的人用的是10微克/毫升，4度過(guò)夜。
3.還有我見(jiàn)一篇文獻(xiàn)《成人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞分離和誘導(dǎo)分化》中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)J Cent South Univ (M ed Sci) 　2005， 30 (5)上面寫(xiě)的是1微克/毫升，37度過(guò)夜。
至此產(chǎn)生一個(gè)疑問(wèn)：是不是這幾種方案都可行？濃度越高的，需要的溫度就越低，時(shí)間就越短，而最后達(dá)到的效果是一樣的？
如果真是這樣，那么以上3個(gè)方案是一個(gè)比一個(gè)便宜啊，那我干脆用第3方案得了？第1方案比第3方案貴了五十倍啊！比第2方案也貴了五倍。
非得花那么多錢(qián)嗎？FN不便宜啊！
各位戰(zhàn)友，我摸索了好幾次，總共試驗(yàn)了以下方案：
1.50ug/ml，4度過(guò)夜；
2.10ug/ml，4度過(guò)夜；
3.50ug/ml，室溫下放置45分鐘至一小時(shí)；
4.10ug/ml，37度過(guò)夜；
5.1ug/ml，37度過(guò)夜。
現(xiàn)在養(yǎng)到了第四天，自我感覺(jué)貼壁效果最好的是方案4，而且該方案所用的FN還是方案2用過(guò)一次的，我把它回收了又重復(fù)利用，已經(jīng)經(jīng)過(guò)了一次凍融，按理說(shuō)效果應(yīng)該下降了不少了，但是它的貼壁時(shí)間早，細(xì)胞多而且形態(tài)比較接近長(zhǎng)梭形，還聚集形成了很多集落樣的結(jié)構(gòu)，如下圖：
至于溶解分裝，我是用滅菌注射用水1ml將其溶解為1mg/ml，然后分裝為八支EP管，負(fù)二十度保存。
我要用人纖連蛋白包被培養(yǎng)板養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)問(wèn)自己如何包被，有無(wú)其他方法可替代？
以10μg/μl的纖連蛋白(Fibronectin)于4℃包被培養(yÇŽng)板過(guò)夜，接種細(xì)胞就可以了。
我用羅氏的Fibronectin 1mg/瓶，說(shuō)明書(shū)推薦：配成50ug/ml，包被用量5ug/平方厘米。室溫下包被40分鐘，然后吸掉多余溶液，注意培養(yǎng)板不能干掉，包被后立即使用，可用PBS沖洗，但沒(méi)必要。具體濃度可根據(jù)實(shí)際需要調(diào)整(1～5ug/cm2)
(四)刀豆蛋白A包被：
問(wèn)：我現(xiàn)在進(jìn)行胰腺細(xì)胞培養(yǎng)，需要用刀豆蛋白A（Concanavalin A）包被細(xì)胞培養(yǎng)板。卻不知如何使用。想請(qǐng)教各位：Con A用什麼溶液溶解、多大濃度、包被需要多長(zhǎng)時(shí)間。
答：包被液：Buffer A 碳酸鹽緩沖液（PH 9.5 0.05M），Na2CO3.10H2O 0.107g ，NaHCO3   0.073g ，二蒸H2O 25ml
包被液：10 ml+100ul2%NaN3+50ug抗原（5ug/ml）每孔100ul 。
(五)肝素化：
問(wèn)：如何肝素化培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)板，用于細(xì)胞與全血的共同培養(yǎng) ？
答：用1250-2500 u/ml的肝素，濕潤(rùn)培養(yǎng)皿或板，然后傾去既可。
(六)病毒包被：
問(wèn)：我要做間接ELISA檢測(cè)抗體。要先把病毒包培養(yǎng)板，不知道怎么做！
答：我也沒(méi)做過(guò)， 但我覺(jué)得病毒事實(shí)上也是蛋白顆粒，，在物理性質(zhì)上與普通蛋白無(wú)異，因此我覺(jué)得就是一個(gè)普通蛋白的包板而已。用碳酸鹽緩沖溶液。。4度過(guò)夜就行。。。，。。。
首先將病毒用包被緩沖液稀釋成最佳濃度包被，四度冰箱過(guò)夜。次日用洗滌液洗滌3 次。再將一抗加入其中。最后加入酶標(biāo)抗體。
最重要的一點(diǎn)，為防止病毒的擴(kuò)散傳播，一般事先都滅活才包被。
(七)anti-CD3單抗包被：
問(wèn)：soluble anti-CD3單抗包被培養(yǎng)板時(shí)用PH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)?qǐng)問(wèn)PH9.6的碳酸鹽緩沖液的配方是什么。另外IL-2在培養(yǎng)體系中用U/ml和ng/ml，請(qǐng)問(wèn)這如何換算。
答：包被液（pH9.6碳酸鹽緩沖液）：精密稱(chēng)取碳酸鈉 0.32g ，碳酸氫鈉 0.586g ，加水溶解，定容至200ml。
U/m是細(xì)胞因子的活性單位，細(xì)胞因子作用于特定的靶細(xì)胞，影響靶細(xì)胞的生物活性或細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)，通過(guò)檢測(cè)靶細(xì)胞的生物學(xué)活性或細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)變化，可間接反應(yīng)細(xì)胞因子水平，所以生物學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果表示為相對(duì)單位或生物活性單位，一般是通過(guò)與細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品的所測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照得出生物活性單位。而ng/ml是一個(gè)濃度單位，是通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)方法得到的一個(gè)定量結(jié)果，檢測(cè)的是細(xì)胞因子以及與細(xì)胞因子有交叉抗原的細(xì)胞因子前體等，常用ELISA法，如多克隆抗體和單克隆抗體，識(shí)別不同表位兩種單抗的雙抗體夾心法。由于結(jié)構(gòu)和功能的不一致性，以及其它因素干擾，免疫學(xué)測(cè)定法和生物學(xué)測(cè)定法結(jié)果并不等同，所以?xún)煞N單位之間也是無(wú)法換算的。必要時(shí)，可同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。
一）培養(yǎng)板的清洗和消毒
培養(yǎng)板一般為一次性使用，尤其在接觸了有毒、有害等物質(zhì)后更應(yīng)該處理后丟棄。但如果要反復(fù)使用則一定要進(jìn)行正確的清洗和消毒，以保證細(xì)胞培養(yǎng)的效果。
問(wèn)：只有紫外照射可以保證無(wú)菌嗎?可不可以從清洗方面做點(diǎn)工作?
答：看你什么用途了，一般貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用重復(fù)利用的培養(yǎng)板效果不是很好，因?yàn)榕囵B(yǎng)板表層在生產(chǎn)時(shí)涂有一層促進(jìn)細(xì)胞貼壁的物質(zhì)，在清洗后多半會(huì)失去。懸浮或是半懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞還可以。
我們一般是先泡酸過(guò)夜，清洗干凈，三蒸水清洗，再用無(wú)水酒精浸泡清洗，再在工作臺(tái)里用無(wú)菌水過(guò)一遍，在蓋上蓋子在烘箱里烤干，待烤干后，打開(kāi)在超凈工作臺(tái)里近紫外（距離紫外燈<２０ｃｍ）照射半個(gè)小時(shí)以上，效果很好，沒(méi)有污染過(guò)。
其實(shí)不管老板有錢(qián)沒(méi)錢(qián)，我們做實(shí)驗(yàn)室尤其是預(yù)實(shí)驗(yàn)或是摸條件時(shí)，我們一般都能省就省了，留點(diǎn)錢(qián)還不如買(mǎi)點(diǎn)好試劑呢：）
我們一般是先清洗干凈，泡酸過(guò)夜，三蒸水清洗，在蓋上蓋子在烘箱里烤干，待烤干后，有兩種選擇：1、在超凈臺(tái)里近紫外燈（距離紫外燈<3０ｃｍ）照射半個(gè)小時(shí)以上，六孔板一般半個(gè)小時(shí)，24孔板一個(gè)小時(shí)，96孔板時(shí)間更長(zhǎng)，效果很好，沒(méi)有污染過(guò)；2、到放射科照Co60，照完了盡快用。
我們這里腫瘤細(xì)胞耐性很好，所以重復(fù)利用沒(méi)什么問(wèn)題，如果原代培養(yǎng)比較嬌貴的細(xì)胞最好用新板子，也不是很貴。
我們的經(jīng)驗(yàn)是:清洗后用消毒液浸泡，泡酸過(guò)夜，自來(lái)水反復(fù)沖洗，雙蒸水沖洗三遍，無(wú)塵環(huán)境晾干，用之前紫外燈照射半小時(shí)以上，效果很好。我們現(xiàn)在的窮同仁一直在應(yīng)用。
永久了也會(huì)變黃，因此如果做mtt或比色時(shí)是不能用的，在不熟悉細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)候可以先學(xué)學(xué)細(xì)胞記數(shù)，熟練了用新的，不過(guò)腫瘤細(xì)胞可以在舊板子上長(zhǎng)得很好喲，原代的細(xì)胞比較難養(yǎng)，塑料的較好。
紫外的穿透能力很弱，板子紫外照射時(shí)是否將蓋子翻過(guò)來(lái)一起照射那？還有，細(xì)胞瓶紫外效果如何？
板子泡酸后和瓶子一樣的清洗方法清洗后，60度烤干，然后放在工作臺(tái)里（打開(kāi)蓋子）用紫外線(xiàn)照射半小時(shí)以上，最好一小時(shí)或兩小時(shí)，蓋子同時(shí)反過(guò)來(lái)照。瓶子照射沒(méi)有效果，要用其他方法
同意樓上大家的意見(jiàn)。96孔和24孔板子在做完了后要先泡清洗計(jì)，在用棉花搽洗每個(gè)孔，這樣有些貼壁細(xì)胞才不會(huì)有細(xì)胞碎片的殘留，在做mtt是很重要，要不很不準(zhǔn)的。后面就是沖洗，泡酸，3蒸水洗，紫外照射30－60分鐘，不要時(shí)間太長(zhǎng)，這樣板子容易變色！但是如果是做MTT還是建議用新板子！舊板子做，結(jié)果不準(zhǔn)！
泡酸時(shí)不要用剛配好的濃酸，因?yàn)槟菢訒?huì)把培養(yǎng)板表面促進(jìn)細(xì)胞貼附的一層膜腐蝕掉，細(xì)胞就無(wú)法貼壁了。用酸泡完后用自來(lái)水清洗，再用蒸餾水清洗3－5次，然后泡在75％的酒精里（酒精用純的無(wú)水乙醇），用前在紫外線(xiàn)下照射1h。基本可保證95％以上無(wú)菌，用這些板做做預(yù)實(shí)驗(yàn)是沒(méi)問(wèn)題的。
1.鈷60照射適合大量的板同時(shí)滅菌，最好攢一箱，再送去滅菌。
2.紫外消毒適合少量的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板，比如培養(yǎng)板，將蓋打開(kāi)，翻過(guò)來(lái)，連同板一起在紫外下照射2小時(shí)即可，事先不用酒精泡。
(二)方法討論
細(xì)胞培養(yǎng)板常用來(lái)進(jìn)行不同的處理效應(yīng)觀(guān)察，有些檢測(cè)可能直接就在培養(yǎng)板中進(jìn)行，這里面有些什么樣的經(jīng)驗(yàn)或小竅門(mén)呢？
1．細(xì)胞培養(yǎng)與MTT
問(wèn):做MTT時(shí)，96孔培養(yǎng)板細(xì)胞濃度該是多少？
答:我覺(jué)得細(xì)胞的濃度并不需要那么精確，關(guān)鍵是接種于每孔的細(xì)胞數(shù)就大致處于同一水平。
比如我做MTT，起初用的細(xì)胞濃度為5000/ml，每孔100ul，培養(yǎng)3天觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)太少，各孔OD值反面難于比較。后來(lái)我換用10000/ml，結(jié)果就很好。
當(dāng)然細(xì)胞數(shù)也不能太多，這其實(shí)取決于你細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，生長(zhǎng)快的細(xì)胞，可接種濃度低點(diǎn)。這主要是使細(xì)胞增殖率不致受處理因素之外的其他因素影響，比如接觸抑制，營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)。
總之，做MTT時(shí)細(xì)胞數(shù)應(yīng)較低，目的就是為了排除其他因素的影響，以使每孔細(xì)胞生長(zhǎng)情況盡可能地反映出處理因素的影響。
細(xì)胞接種的濃度和你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒁蟆⒓?xì)胞種類(lèi)、處理因素的特殊要求都有關(guān)系。沒(méi)有簡(jiǎn)單的，每孔接種多少的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)然，可以用樓上建議的濃度開(kāi)始摸索。同時(shí)，注意腫瘤細(xì)胞核正常細(xì)胞的生長(zhǎng)數(shù)度也不一樣，前者生長(zhǎng)快，后者慢，細(xì)胞數(shù)的量也有講究。到底多少合適，得根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)具體要求來(lái)摸索。我做b16轉(zhuǎn)染時(shí)，因?yàn)橹|(zhì)體要求細(xì)胞融合度為30%-50%，曾經(jīng)沒(méi)孔接種過(guò)300-500個(gè)細(xì)胞，效果非常好，
問(wèn):我做的MTT為什么同一組的兩孔差別那么大呢？做了兩次都是這樣！
答:產(chǎn)生差別的原因有多種
1.在加細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞沉淀下來(lái)，導(dǎo)致兩孔細(xì)胞數(shù)不同。我們通常用磁力轉(zhuǎn)子對(duì)細(xì)胞緩慢攪拌，時(shí)刻保持細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)。
2.96孔板在培養(yǎng)箱中，由于濕度不夠，而培養(yǎng)箱由于具有一定的溫度，使得邊緣的孔水分蒸發(fā)較快，導(dǎo)致培養(yǎng)基中各種成分濃度變化增大，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不同。對(duì)于這種現(xiàn)象，要保證培養(yǎng)箱中的濕度，減少開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱的次數(shù)和時(shí)間。
對(duì)于生長(zhǎng)較快的細(xì)胞，例如每12小時(shí)到24小時(shí)就傳代一次的細(xì)胞，應(yīng)該起始濃度低一些，我一般是96孔板每孔加10 4個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)液每孔加200ul。
有些細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，例如72小時(shí)才傳代一次，或者是原代細(xì)胞，起始濃度應(yīng)高一些，我一般是96孔板每孔加2X10 4個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)液每孔加200ul。
問(wèn):96孔板培養(yǎng)板能否代替酶標(biāo)板測(cè)吸光度？是可以拆成一條一條的那種好還是不可以拆的好？
1.最好是用酶標(biāo)板，因?yàn)?6孔板的各孔透光性不一致;
2.拆成一條條的方便使用一些。
MTT法計(jì)數(shù)細(xì)胞的相對(duì)數(shù)，可以對(duì)96孔板培養(yǎng)的細(xì)胞在用藥物刺激后的直接計(jì)數(shù)；也可以把細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，加到96孔板中，然后加MTT孵育、計(jì)數(shù)。
所以，如果是前者，必須用培養(yǎng)板；如果是后者，可以用酶標(biāo)板。平底的，酶標(biāo)板好一些。
問(wèn)：我的干預(yù)因素是乳劑（白色），對(duì)結(jié)果可能會(huì)有影響吧，如何才能減少這些干擾?
答：當(dāng)然可以用，如果你害怕干擾因素對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，那么建議你設(shè)定一空白調(diào)零孔，如100ul的培養(yǎng)基加上10ul的藥物，測(cè)定的樣品吸光度減去空白調(diào)零孔即可！
測(cè)單一時(shí)間點(diǎn)的OD值，直接在培養(yǎng)板里就是了。測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的，需要在不同的培養(yǎng)板里。細(xì)胞在培養(yǎng)板里側(cè)就是了。干擾因素可以測(cè)前離心一下。
問(wèn)：看到很多討論說(shuō) 96孔四周不做數(shù)據(jù)處理，那么還是要加細(xì)胞或培養(yǎng)基嗎？如果我把四周設(shè)為空白孔（不加細(xì)胞）作為陰性對(duì)照，可以用來(lái)調(diào)零或計(jì)算抑制率不？
答：可用只加培養(yÇŽng)基組作為正常對(duì)照組，來(lái)計(jì)ç®—ç´°(xì)胞生存率=給藥組MTT/正常組MTT×100%，余空可不加任何物質(zhì)。　　MTT不同與做ELISA需要設(shè)立空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，這其中的空白對(duì)照一般用PBS，目的是去除板底效應(yÄ«ng)。
實(shí)際上，對(duì)于96孔板的細(xì)胞培養(yǎng)可以采取一個(gè)方法來(lái)改變出現(xiàn)誤差的情況，就是將你的分組打亂，不要讓你同一組的細(xì)胞集中排在一個(gè)區(qū)域，盡量打亂，就可以了
首先，分析原因，即必須知道在96孔板四周做數(shù)據(jù)處理會(huì)有什么影響。
因?yàn)?6孔板的密封性比較良好，也就是說(shuō)培養(yǎng)箱內(nèi)空氣中的O2是透過(guò)板四周很小的空隙進(jìn)入培養(yǎng)板的，細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2也是通過(guò)四周空隙從板內(nèi)排出來(lái)的。在板內(nèi)外氣體交換時(shí)，37度條件下，板內(nèi)的水汽也被大量帶出板外。這樣，就會(huì)造成96孔四周孔內(nèi)的體積減少，如果細(xì)心一點(diǎn)，就會(huì)發(fā)現(xiàn)外外周孔內(nèi)培養(yǎng)基的體積明顯小于內(nèi)部的體積。因此，如果最外一周有細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，則會(huì)因培養(yǎng)基成分的濃度偏高而對(duì)細(xì)胞有影響，同時(shí)也會(huì)因?yàn)轶w積變化在做加入藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，藥物濃度偏高而對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響。
因此，在具體操作時(shí)，可以采用以下對(duì)策：
知道原因，我們可以跟據(jù)實(shí)驗(yàn)情況選擇PBS或D－Hanks溶液，因?yàn)橥庵芗尤脒@種成本低廉的溶液，一方面可以減少內(nèi)部各孔中細(xì)胞培養(yǎng)液中水份的損失，另一方面，可以做為分析染菌等突發(fā)事故的原因，進(jìn)行排查，找到染菌源頭。當(dāng)然，因?yàn)樽鱉TT時(shí)，你本身會(huì)做空白對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照，所以你可以完全不用管本底帶來(lái)的誤差了（建議你采用中間列6個(gè)孔為空白對(duì)照組，剩下共有9組54個(gè)孔，正好可以做三個(gè)藥，每個(gè)藥可設(shè)高、中、低三個(gè)濃度；加細(xì)胞時(shí)，你采用隨機(jī)加細(xì)胞法，反正60孔細(xì)胞你加滿(mǎn)就可以放心去培養(yǎng)了！）。
2．細(xì)胞培養(yǎng)板與ELISA
問(wèn)：請(qǐng)教各位，做ELISA能否用培養(yǎng)板呢，有什么差別呢？
答：應(yīng)該用ELISA試驗(yàn)專(zhuān)用板子。細(xì)胞培養(yǎng)板是不行的。ELISA專(zhuān)用板條，是經(jīng)過(guò)處理的，要求每孔的均一性要好；而細(xì)胞培養(yǎng)板同樣經(jīng)過(guò)處理，但是是為了細(xì)胞更好地貼壁生長(zhǎng)，使用細(xì)胞培養(yǎng)板可能會(huì)造成孔與孔之間的顯色沒(méi)有可比性。
所以，細(xì)胞培養(yǎng)板可以做要求不嚴(yán)格的定性ELISA實(shí)驗(yàn)，而其他情況，應(yīng)當(dāng)使用正規(guī)ELISA板條。
問(wèn)：大家的ELisa板有沒(méi)有重復(fù)利用啊，我們這里重復(fù)利用，但是沒(méi)有洗板機(jī)，就人工洗一下，然后煮沸，再烘干，不知這樣是否合理啊，我感覺(jué)還是新板的效果好些，還請(qǐng)高手指教！
答：細(xì)胞培養(yǎng)板用于定性或要求不是很高還可以，對(duì)于定量試劑最好用酶標(biāo)板，可以提高均一性減少差異，而且強(qiáng)吸附酶標(biāo)板還可以減少包被抗原或抗體的用量，因此最好用酶標(biāo)板。
ELisa板一般不能重復(fù)利用。一是對(duì)板子均勻性的要求高，重復(fù)使用難達(dá)到。二是不劃算，一塊板子的試劑便宜的要幾百元，貴的要幾千元，而一塊空板貴的也就幾十元，便宜的還不到10元，再將樣本的價(jià)格和耗費(fèi)的時(shí)間加上，而得到不靠的結(jié)果，你說(shuō)應(yīng)該如何辦？
洗板機(jī)不是清洗重復(fù)使用板子的，而是在加樣過(guò)程中為了提高自動(dòng)化程度洗板子用的（洗滌是ELISA實(shí)驗(yàn)步驟之一）。
3．細(xì)胞培養(yǎng)板與免疫組化
問(wèn)：在塑料的細(xì)胞培養(yǎng)板上，進(jìn)行免疫組化應(yīng)當(dāng)怎樣合適，有沒(méi)有這樣的技巧？
答：完全沒(méi)有什么特別的，只是在最后封片的時(shí)候，有些不同。還有需要注意的是每一步加液體時(shí)應(yīng)從培養(yǎng)孔的壁上輕輕加上。使液體慢慢到達(dá)孔底，我第一次作時(shí)，沒(méi)注意到這一點(diǎn)，到最后細(xì)胞所剩無(wú)幾，所以雖是細(xì)節(jié)問(wèn)題，但很重要 。